产品货号：
YTB4165
中文名称：
Klenow片段
英文名称：
Klenow Fragment
产品规格：
200U|1000U|5000U
发货周期：
1～3天
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Klenow Fragment又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I (E.coli.DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。Klenow Fragment的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性(proofreading)，本制品。
对于5'突出或3'突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。
双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3'突出(3'overhang)末端的打平(也称削平)；5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。
由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA基因片段。
37℃ 30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：67mM potassium phosphate (pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml [3H]-dTTP,62.5μg/mL poly(dA-dT)·poly(dA-dT).
| 组分 | 200U | 1000U | 5000U |
| Klenow Fragment (5U/μL) | 40μL | 200μL | 1mL |
| 10×Reaction Buffer | 200μL | 1mL | 5mL |
保存：-20℃
25mM Tris-HCl (pH7.5),0.1mM EDTA,1mM DTT,50% (v/v) glycerol。
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl，50mM MgCl2，10mM DTT，pH8.0@25℃。
不含DNA内切酶，不含RNase；单体分子量约68kDa
75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment有抑制作用。
- 双链DNA 5'突出末端的补平：
- 对于双链DNA 5'突出末端的补平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
成分 用量 终浓度 Nuclease-Free Water (16.6-x)μL - dsDNA with 5'Overhang xμL ~0.5μM or 5～200ng/μL 10×Reaction Buffer 2μL 1× dNTP Mix (2.5mM each) 0.4μL 50μM Klenow Fragment(5U/μL) 1μL 0.25U/μL 总体积 20μL - - 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- dsDNA with 5'Overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5μM，如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5～200ng/μL。
- 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- 反应条件：37℃孵育10分钟。
- 终止反应：75℃孵育10分钟以终止反应。
- 对于双链DNA 5'突出末端的补平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
- 双链DNA 3'突出末端的打平：
- 具有3'突出末端的杂交双链DNA的退火。
将单链DNA 1和DNA 2等摩尔数混合，推荐的终浓度为10μM，95℃孵育2min，然后通过梯度降温至25℃退火形成具有3'突出末端的杂交双链DNA。推荐使用DNA寡核苷酸退火缓冲液，并按照该产品使用说明进行退火反应(退火后的双链DNA推荐在-20℃保存)。 - 对于双链DNA 3'突出末端的打平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
成分 用量 终浓度 Nuclease-Free Water (17-x)μL - dsDNA with 3' Overhang xμL ~0.5μM or 5～200ng/μL 10×Reaction Buffer 2μL 1× Klenow Fragment (5U/μL) 1μL 0.25U/μL 总体积 20μL - - 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 3'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- dsDNA with 3'Overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5μM，如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5～200ng/μL。
- 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 3'overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5'overhang。
- 37℃孵育10分钟。
- 75℃孵育10分钟以终止反应。
- 具有3'突出末端的杂交双链DNA的退火。
- 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记：
- 参考如下表格设置反应体系：
成分 用量 dsDNA with 5'Overhang 10～15μL (0.1～4μg) 10×Reaction Buffer 2μL [α-32P]-dNTP,~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
或[α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)0.74 MBq (20μCi)
或2.96 MBq (80μCi)3 dNTP Mixture (2.5mM each,without the labeled dNTP) 2μL Klenow Fragment 0.2μL(1U) 无核酸酶去离子水 至20μL - 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
- 30℃孵育15分钟。
- 75℃孵育10分钟终止反应。
- 参考如下表格设置反应体系：
- 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。
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